纳米颗粒跟踪分析技术(NTA):多领域广泛应用的纳米颗粒表征技术
一、引言
随着纳米技术的飞速发展,纳米颗粒在众多领域展现出巨大的应用潜力,如生物医药、材料科学、环境科学等。在这些应用中,精确测定纳米颗粒的尺寸、浓度、表面电荷等特性至关重要,因为这些参数直接影响着纳米材料的性能、稳定性以及与生物系统的相互作用。传统的纳米颗粒分析技术,如电子显微镜(EM)和扫描探针显微镜(SPM),虽然能够提供高分辨率的图像,但样品制备复杂、检测通量低,且通常只能对静态样品进行分析,难以满足对纳米颗粒在溶液中动态行为研究的需求。动态光散射(DLS,图1B)技术作为一种常用的光学集合技术,长期以来被广泛应用于纳米颗粒分散体系的分析,能够快速、准确地测定颗粒尺寸。然而,DLS 在面对多分散样品时可靠性下降,其获得的强度加权平均尺寸(“z 平均”)并不总能准确反映样品的真实组成。此外,通过经典反卷积算法对相关函数进行分析以提取例如双峰分布的能力,实际上仅限于仅包含两种或至多三种尺寸颗粒类型的样品,且每种颗粒类型的尺寸差异需在实践中大于 3:1。纳米颗粒跟踪分析技术(NTA,图1A)的出现为纳米颗粒的表征提供了一种全新的解决方案,它能够实时、逐个地跟踪和分析纳米颗粒在溶液中的布朗运动,从而获取颗粒的尺寸、浓度等信息,弥补了传统技术的诸多不足。
图1,NTA(A)与DLS(B)的原理图
二、NTA技术原理
NTA 技术基于激光光散射原理,一束精细聚焦的激光束穿过含有纳米颗粒稀悬浮液的样品池。激光束在液体样品与光学元件的界面处发生折射,使其路径接近与玻璃 - 样品界面平行。位于光束内的颗粒,通过与光束轴垂直对齐的常规光学显微镜进行可视化观察,该显微镜收集视野内每个颗粒散射的光。由于 NTA 本质上并非成像技术,系统的总放大倍数相对适中,对于适当稀释的样品,颗粒在显微镜视野内呈现为在布朗运动下移动的光散射中心。拍摄一段时长通常为20 - 60秒(每秒30帧左右)的运动颗粒视频,借助专有分析程序逐帧处理。程序自动识别、定位每个颗粒,跟踪其帧间移动。颗粒识别阈值、相机增益与快门速度等参数可由用户根据样品类型调整,以优化图像。扩散进入散射体积的颗粒被识别并跟踪,直至其离开光束或靠近相邻颗粒致跟踪终止,有效避免因颗粒轨迹交叉导致的错误结果。依据布朗运动理论,球形颗粒的扩散系数(Dt)与粒径遵循斯托克斯 - 爱因斯坦关系:
其中KB为玻尔兹曼常数,T为绝对温度,η为粘度,d为流体动力学直径。颗粒在溶液中的布朗运动速度与其粒径有关。较小的颗粒由于受到的流体阻力较小,布朗运动速度更快。反之,较大颗粒的布朗运动更慢。通过分析颗粒的布朗运动轨迹,可以计算出颗粒的扩散系数,进而推算出颗粒的粒径。
三、纳米颗粒跟踪分析技术的优势
1、多参数同时分析能力
与传统的 DLS 技术只能提供强度加权平均尺寸不同,NTA 能够在跟踪颗粒布朗运动计算尺寸的同时,测量颗粒散射光的强度,从而生成强度 - 尺寸二维图。这使得即使对于非单分散的样品,如不同直径混合的二氧化钛纳米颗粒,也能通过二维图更清晰地分辨出各个颗粒群体。此外,NTA 还可通过引入电极施加电场,分析带电颗粒在电场中的电泳迁移率,实现颗粒尺寸与电泳迁移率的同时测量。以羧化的 150nm 颗粒为例,在施加电场前,可通过分析其布朗运动确定颗粒大小,施加 30V 电场后,颗粒向阳极移动,其电泳轨迹可被可视化并分析,且布朗运动不受电泳运动的影响,能够同时提取颗粒的尺寸和电泳信息。
2、高分辨率的颗粒尺寸分布测定
NTA 技术能够以超越 DLS 的分辨率分辨不同颗粒尺寸,对于多分散体系具有显著优势。如对 100nm 和 300nm 聚苯乙烯校准微球的混合物进行分析,能够清晰地呈现出双峰分布,并且以颗粒数量为函数展示尺寸分布,可准确获得每个尺寸类别的颗粒浓度(颗粒数/ml),为复杂样品中不同尺寸颗粒群体的定量分析提供了有力手段。
3、实时监测颗粒动态变化
NTA 通过光学显微镜成像和颗粒追踪算法,能够直观地观察到纳米颗粒在溶液中的运动轨迹和行为,可实时监测纳米颗粒的聚集、分散等动态过程,有助于深入理解纳米颗粒的物理化学性质和行为变化。由于 NTA 是对单个颗粒进行实时跟踪分析,它能够捕捉到颗粒在溶液中的动态变化过程。例如,在研究病毒颗粒与金属盐溶液相互作用时,随着时间推移,病毒颗粒表面形成金属涂层,导致其折射率增加,虽然颗粒直径无显著变化,但通过 NTA 的二维强度 - 尺寸图可实时观察到这一变化,直观地反映出颗粒性质的动态演变。
四、NTA仪器构成
典型的NTA仪器主要由激光光源、显微镜、样品池、相机及数据分析软件组成(图2)。激光光源提供稳定且聚焦良好的光束;显微镜用于观察颗粒散射光,其光学性能影响颗粒可视化效果;样品池容积约250µl、深度500µm,带有Luer接口,方便通过注射器进样,且能确保样品在分析前20秒达到热平衡;相机(CCD或CMOS相机)捕捉颗粒散射光图像,其灵敏度与帧率对数据采集质量关键;数据分析软件则负责处理视频数据,实现颗粒追踪、参数计算与结果呈现。
图2,NTA的结构示意图
五、NTA技术在多领域的应用进展
纳米颗粒跟踪分析仪的用途非常广泛,在科研系统的研究领域里,可以在脂质体和药物传递纳米颗粒、蛋白质聚集物、10-1000nm金属和无机纳米颗粒、高分子纳米悬浮液、稀土纳米颗粒及量子点/多层碳纳米管、疫苗研发、纳米气泡、纳米毒理学和生物标记物、细胞外泡(外泌体和微泡)等领域进行粒径大小测量、浓度测量、荧光纯度检测及Zeta电位测量。因此其在生物医学、药物开发、纳米材料科学、环境科学、化学工程等领域广泛使用。
图3、NTA的应用领域
1、药物递送
通过精确测量颗粒尺寸分布和浓度,研究人员可以更好地优化递送载体的设计和制备工艺,确保药物能够以合适的粒径和浓度到达目标部位,从而提高药物的疗效和安全性,这也是在药物研发过程中对这些参数进行测量具有重要意义的原因。
2、材料科学领域
在纳米材料合成与表征中,NTA用于实时监测纳米颗粒生长过程,追踪粒径、浓度随时间变化,助力优化合成工艺参数,如制备金纳米颗粒时,精确调控粒径分布。在材料稳定性研究方面,可检测颗粒团聚、沉降等变化,评估不同环境条件(温度、pH、离子强度)对材料稳定性影响,为纳米材料长期储存与应用提供依据。
3、病毒学与疫苗生产
准确计数和测量病毒、噬菌体及其聚集体对于疫苗研发、生产及质量控制至关重要,保障疫苗的质量和稳定性,确保疫苗在预防疾病方面的有效性和安全性。
4、蛋白质聚集物
在细胞培养、纯化、配方、包装和储存等多个单元操作过程中都可能发生蛋白质聚集。确定蛋白质聚集的状态和动力学对于提高产品稳定性和优化生产过程具有重要意义。
5、环境科学领域
监测环境水样、大气颗粒物中的纳米颗粒,分析其来源、成分、迁移转化规律。如研究水中金属纳米颗粒污染,NTA结合其他分析技术,识别颗粒种类、粒径范围,评估潜在生态风险,为环境监测与污染治理提供数据支持。
6、纳米气泡
纳米气泡具有广泛的应用潜力,包括在药物递送、清洁和消毒等方面。NTA技术在纳米气泡研究中发挥着重要作用,它能够直接在溶液中可视化纳米气泡,并提供关于气泡尺寸和浓度的信息。
7、外泌体外囊泡
保证外泌体的原始状态条件下,对外泌体,外囊泡进行快速实时动态检测,测量参数包括颗粒粒径、散射光强、浓度等,可对抽提获得的外泌体进行粒径大小及数量进行统计。搭配响应的激光器与滤片,可在复杂背景条件下,使用荧光抗体标记外泌体,可对外泌体进行荧光测量。
六、总结
纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)能实现对单个纳米颗粒的实时、同步多参数分析,提供粒径、浓度、表面电荷等丰富信息,这是传统方法难以企及的。对于多分散体系,NTA可精准分辨不同粒径颗粒群体,准确反映样品真实情况。操作相对简便,样品制备要求低,分析速度快,能在短时间内给出结果,大幅提高研究效率。
NTA凭借其可靠的原理、先进的仪器设计、简便的操作流程以及优异的性能优势,在纳米材料研究的各个领域展现出强大的应用潜力。通过与传统纳米颗粒分析方法的对比,凸显了其在多参数分析、高分辨率粒径测定、实时动态监测等方面的不可替代性。随着纳米科技的持续发展,NTA技术有望在更多领域得到深入应用与拓展,不断推动纳米材料的创新研发、产品质量提升以及纳米技术与其他学科的交叉融合,为解决诸多科学与工程难题提供有力的技术保障,开启纳米表征技术的新篇章。
关于纳米颗粒跟踪分析仪LighTracker
LighTracker是由四度科学仪器精心打造的新一代纳米颗粒跟踪分析仪(NTA),为纳米颗粒分析带来令人惊叹的高效与精准。仅需几分钟,便能全面呈现纳米颗粒的粒径分布信息,涵盖最小粒径、最大粒径,以及各个粒径区间颗粒的数量占比,为纳米颗粒的精细研究提供详尽数据。不仅如此,LighTracker还具备强大的荧光检测功能和Zeta电位测量能力,为纳米药物载体的制备、细胞外囊泡的分析提供关键支持。LighTracker能够实时追踪纳米颗粒在不同环境条件下的浓度变化,深入剖析纳米颗粒在环境及反应中的扩散、迁移、转化与降解过程。让科研工作者能够直观地观察纳米颗粒的行为变化,为纳米材料的研发、纳米药物的疗效评估以及纳米环境毒理学研究提供了有力工具。
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