L929细胞转染步骤

 L929细胞转染步骤 ：

L929是小鼠成纤维细胞瘤细胞株，经常被用来检测TNF-alpha及TNF-beta。对TNF的处理经常会引发细胞凋亡及死亡，因此L929细胞经常被用作免疫分析。但是，转染L929细胞非常难，尤其使用基于脂质体技术的转染试剂，我们使用GenJet VerⅡ及PolyJet转染L929细胞获得了75%的转染效率，简单的实验步骤如下。

1、转染时确保L929细胞达到80%的融合度，细胞必须健康并且传代不能超过9代。

2、对于6孔板，用不含血清的DMEM分别稀释1.0μg，DNA及3.0μl，Genjet VerⅡ或PolyJet转染试剂。将稀释好的转染试剂加入DNA中，室温下放置15分钟以形成转染复合物，其它规格的细胞培养器皿，可以根据表面积适当调整DNA含量。

3、将转染复合物直接加入L929细胞中；6孔板， L929细胞转染步骤 每孔含1.0ml培养基，在血清/抗生素存在下,转染进行。

4、转染后的24~48小时，监测转染基因的表达情况。

Brief procedures for transfecting L929 cell.
L929 is a murine aneuploid fibrosarcoma cell line which isoften used to assay TNF-alpha and TNF-beta. Treatment with TNF initiatesapoptosis and subsequent cell death, therefore L929 cell is often used forimmunological assays. However L929 cell is hard to transfect, especiallyresistant to liposome based transfection method. We have been using GenJet Ver.II and PolyJet to transfect L929 cell and got up to 75% efficiency. The briefprocedures are described below for transfecting L929 cells with GenJet andPolyJet.
1. Grow L929 cell to ~80% confluency at the day of transfection. L929 cell mustbe healthy and less than 9 passages for maximum efficiency.
2. For 6-well plate, dilute 1.0 μgof DNA and 3.0 μl of GenJet Ver.II or PolyJet reagents per well with serum free DMEM respectively. Add dilutedreagent to diluted DNA and let transfection complex formed at RT for 15minutes.  For other format of cell culture formats, scale down or up perthe surface area of culture dish.
3. Add transfection complex to L929 cell directly. Transfection is conducted inpresence of serum/antibiotics with transfection volume of 1.0 ml per well of6-well plate.
4. Check transgene expression 24~48 hours post transfection.

选择GenJetTM，LipoD293TM & PolyJetTMDNA转染试剂稀释溶液的小技巧：

选择何种稀释液稀释DNA及转染试剂，对于制备有效的转染复合物至关重要。除了温度，孵育时间外，稀释液的性质对于制备的转染复合物亦非常重要，同样影响DNA转染效率。根据我们的实验数据，使用合适的稀释液得到的转染效率是使用错误稀释液转染效率的至少50倍。更为重要的是，实验者总是忽视稀释液的重要性，甚至一直未曾意识到正确的稀释液对形成有效转染复合物的重要性。

1、为了制备更有效的转染复合物，稀释液中千万不要含有血清、蛋白。

2、尽量使用接近细胞培养基成分的稀释液，例如：若是你使用DMEM（supplemented with serum and antibiotics）培养HEK293细胞，那么，zui合适的稀释液是不含血清、抗生素的DMEM：若是您使用RPM1-1640（supplemented with serum andantibiotics）培养Hela细胞，那么zui合适的稀释液是不含血清、抗生素的RPM1-1640。

3、请勿使用含有未知成分的培养基。例如，切勿使用Opti-MEMTM稀释GenJet?、PolyJet?及LipoD293? DNA转染试剂。根据我们的实验数据，若是使用Opti-MEM稀释转染试剂及DNA，那么用于HEK293，Hela，CHO及NIH 3T3细胞的转染效率至少减少50%。Opti-MEMTM可能含有较少的血清，导致转染效率的大幅降低。

4、不含血清的高糖DMEM是很好的选择，可以与其他的生长培养基兼容，如果未能得到较高的转染效率，您可能会考虑更换稀释液，若是您不明确如何选择合适的稀释液，建议您初次可以尝试不含血清的高糖DMEM，您应该会得到满意的转染效率。