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瑞芯智造NanoCoulter助力NTA检测标准操作流程建立

2024年09月25日 13:04 来源:瑞芯智造(深圳)科技有限公司

近年来,纳米材料已经在生物医药领域具有了广泛的应用。外泌体、合成纳米颗粒等已被广泛应用于疾病诊断,药物递送等方面。纳米材料的尺寸和浓度对于诊断和治疗效果具有十分重要的意义,纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术是一种常用的表征纳米材料大小和浓度的方法,可以对纳米材料进行快速、精确的粒径和浓度测量。

前人曾多次报道,与 DLS 相比,NTA 在确定单峰和双峰纳米颗粒的尺寸时具有更好的分辨率,但NTA 无法高分辨率解析三个或以上的多峰混合的粒子群。用于数据处理的算法也极大地影响 NTA 和 DLS 分析的粒径结果输出,且二者对样本溶液的粘度十分敏感。同时, NTA的浓度结果被高估已在多项研究中被报道,这种高估可能与测量参数的主观选择以及样品颗粒尺寸和光学性质的不均匀性有关。NTA的尺寸检测限(LOD)与准确的浓度测定有关。然而,目前还没有标准的操作程序来保证测量的准确性和可重复性。在NTA使用过程中,包括样品浓度相机设定参数样品流速等人为设置都会对测量结果造成巨大影响。同时,样品的分散性复杂度也会在很大程度上影响NTA的测量结果。因此,考虑到影响尺寸和浓度准确测量的因素以及设置测量参数时可能存在的主观偏差,需要优化参数的研究以建立标准化方案,从而实现准确浓度测定,以便增加数据的可比性并支持基础研究和质量控制监管部门的批准。






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日前,中科院上海药物研究所于International Journal of Pharmaceutics期刊发表文章Critical parameters to standardize the size and concentration determination of nanomaterials by nanoparticle tracking analysis,系统性地分析了影响NTA准确性的多种参数,并构建了NTA标准化地操作流程。
在文中,作者在系统性地评估了样品浓度,仪器阈值,曝光度,泵流速等参数后,发现NTA在样本浓度为1x108~ 1x109 particles/mL,泵流速为50AU (arbitrary unit) 时,可以得到较为准确的分析结果,但是对于仪器阈值和曝光度这两个参数,作者发现样品粒径会与这两个参数相互影响,因此在进行样品分析的时候,需要具体样品具体分析。

随后,作者利用建立的NTA标准化操作,通过正交实验,横向对比了NTA与透射电子显微镜 (TEM),动态光散射 (DLS),和基于电阻感应脉冲 (RPS) 原理的纳米库尔特粒度仪NanoCoulter对真实且复杂样本的分析能力。





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1. NTA、DLS和RPS对多峰(多模态)样本的表征




作者制备了含有多种不同粒径PS微球的混合样本,分别使用NTA,DLS和RPS(NanoCoulter)进行检测,结果表明NTA对于双峰样本有良好的分辨能力,但是对于三峰和四峰混合样本无法得到正确的结果。DLS对于二峰,三峰样本都无法得到正确的结果。而NanoCoulter则可以成功地对四峰多模态混合样本进行高分辨分析,并且粒径峰位值符合预期标准。


1. 四种不同颗粒表征方法的优缺点


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文中也总结了NTA, DLS, TEM和RPS这四种颗粒分析方法的特点与缺陷。作者认为NTA虽然具有较好的测量分辨率和准确度,但是无法对生物学样本进行更精确的分析,无法确定外泌体样本的来源,同时对于多峰样本仅能对三峰样本实现区分并测量;对于DLS方法,作者认为该方法偏差很大,得到的测量值与真实值具有很大差异,同时该方法无法有效测量颗粒的浓度;作者认为TEM方法可以直接提供颗粒的可视化观察的数据,但是该方法费时费力,投入很高;对于RPS方法,作者认为该方法可以测量颗粒的真实粒径,同时对于四峰样本也可以给出十分精确的测量结果,展现出极其优异的区分能力

RPS可以通过单颗粒分析对通过检测器(纳米孔)的每一个颗粒进行计数统计,计算单位时间/体积下的样品浓度,与NTA等光学计数的方式相比,不存在颗粒散射信号相互遮挡的情况,因此测量的结果准确性更高,非常适合作为光学原理检测方法验证和较准的参考。作者也在最后建议进行复杂样品的粒度分析时,应选取原理不同的多种测试方法进行正交评估,以保证结果的准确性。基于电学原理的RPS技术可以很好地与基于光学方法的NTA或DLS互补,使颗粒粒径分布的表征更为准确。



参考文献
Tian Y, Tian D, Peng X, Qiu H. Critical parameters to standardize the size and concentration determination of nanomaterials by nanoparticle tracking analysis. Int J Pharm. Published online April 10, 2024. doi:10.1016/j.ijpharm.2024.124097
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文章中引用的 NanoCoulter — 纳米库尔特粒度仪, 采用新一代纳米电阻脉冲感应 (RPS) 原理,粒径分辨率(灵敏度)可达到1 nm。依次检测样本中每一个颗粒的原始粒径,实现真正意义上的单颗粒检测,数据精度媲美电镜,专门适用于如外泌体等的多分散性生物样本;可以实现纳米颗粒浓度的精确检测(R>0.999);并且是目前可以兼具单颗粒zeta电位和粒径同时分析的检测方法,直接获得粒径/电位二维散点图,一体化完成外泌体、LNP等纳米颗粒的全面表征与分析,助力基于纳米药物等的科学研究与应用开发。

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关键词: 纳米颗粒

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