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推荐 | NanoCoulter 纳米库尔特粒度仪全面满足MISEV2023最新要求!

2024年09月25日 12:49 来源:瑞芯智造(深圳)科技有限公司

前不久,为了应对细胞外囊泡(EV)领域快速发展的挑战和机遇,逐步完善和统一EV的定义、制备、表征以及功能研究分析等的行业观点和准则,国际细胞外囊泡学会(ISEV)发布了最新的《MISEV》(细胞外囊泡研究的最少信息指南)。MISEV2023汇编了来自ISEV专家组和全球1051名研究人员的反馈,为研究学者提供了最新的研究方法和指导原则,推动EVs和外泌体领域更快更严谨地发展。

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正所谓“五年磨一剑”,最新MISEV2023J Extracell Vesicles期刊中第一次以“立场意见书”(POSITION PAPER)的形式发表,足以可见ISEV学会对本期指南中观点的态度与立场。行业同仁也都纷纷表示这一版MISEV较以往增加很多关于研发方法、实验技术和考虑要点的详细阐述。几乎涵盖了目前该领域前沿先进的技术和方法,旨在提供和综述可用方法的最新建议及其在EV的生产、分离和表征方面的优点和局限性。(指南中有关EV表征的内容已有公众号做了详细解读,可参考阅读《干货:MISEV2023指南解读(一):EV的表征》
其中格外值得注意的是,MISEV2023中在EV的表征(5.1-颗粒数浓度检测,以及5.2-颗粒大小检测)章节,多次提出了几项关键亮点 [1]


  • 没有任何一种测量方法能够满足所有 EV 表征的要求,因此建议使用正交方法(即没有相同测量限制的方法)彼此验证。尤其是光学方法与非光学方法分别检测EV的粒径和浓度(P21, 22, 23, 27, 32, 36)。
  • 需要公布检测方法的 LOD(检测限),从而允许其他人验证结果,而不管灵敏度限制如何。通过使用正交方法可以提高EV 浓度测量的可信度,每种方法都具有确定的 LOD,例如检测光散射强度、荧光强度和物理大小P22, 23, 24, 27, 32, 36)。
  • 需要公布样本连续稀释的浓度结果,以证明所得浓度数据处于系统测量的线性区间内(P22, 32)。
  • EVs是复杂的多分散的生物流体样本。研究者应共享检测到的 EV 直径分布,而不仅仅是平均大小、集中大小或中位值大小等综合指标,这些指标很容易由于 LOD 和不对称大小分布而倾斜(P23, 27, 31, 32, 36, 37)。


圈内读者可以明显看出,这些观点是在过去的MISEV中少有涉及的,而在最新指南中的上述“EV表征”篇幅,乃至后面“EV表征技术特定报告的注意事项”章节中被反复提及,可见ISEV对以上观点的重视程度和强烈建议。
于此同时,作为库尔特原理(电阻脉冲感应,RPS)设备的专业制造商,我们很荣幸地看到MISEV2023也第一次将RPS作为独立原理(非光学)的EV表征技术以单独章节进行了详细论述。文中作者们描述——和体验过NanoCoulter的用户评价的一样——RPS 测量结果确实与 TEM 数据具有非常高的一致性。并且,该章节中也同时建议了采用RPS技术需要考虑的注意事项 [1]


  • 报告RPS检测之前的样本前处理步骤。
  • 建议纳入空白缓冲液的对照,以及相同浓度的样品经去污剂裂解后的结果。
  • 公布所有设备及软件细节。
  • 公布RPS的直径分布,而不是单个粒径统计数据(平均值、集中值、中位值)。


既然国际专家们的立场和意见已经提得如此明确了,那么就让我们一起来看一看作为纳米RPS技术的代表,国际原创、国内自主研发的NanoCoulter纳米库尔特粒度仪是如何一一响应MISEV提出的各项建议和要求的呢?

作为正交方法验证光学表征技术


正交实验方法是研究多因素多水平试验的一种常用设计方法,也就是当确定关键质量属性(CQA)的参数时,推荐采用两种或两种以上不同原理的方法检测同一指标。由于许多EV表征方法不是特定适用于EV的,或者无法检测所有的EV,而检测同一表征参数的正交方法(不止一种原理的方法)不太可能具有相同的偏差,因此使用多种不同原理的表征方法对EV 样本进行分析,互为正交,互相验证,可以更加确保发表的EV数据的可靠性和可重复性。

MISEV2023第一次RPS技术作为与基于流式的方法(包括基于微珠的流式和单EV流式)和基于显微镜的方法(包括原子力显微镜、电镜、DLSNTA、超分辨显微镜等)并列推荐的常用EV颗粒表征方法。RPS方法作为电学原理的技术,也是常用EV粒径和浓度表征中仅有一个“非光学”原理的检测手段,可以很好地同其他光学原理方法(如电镜、NTA、原子力显微镜、纳米流式等)形成正交,彼此验证,从而保障和体现数据地严谨性。NanoCoulter作为RPS设备中的优秀者,已在多家外泌体企事业单位、药品监管机构和国家计量单位中进行过全面验证,并得到大家的可信赖数据(粒径、浓度检测精确度CV%< 5%,准确度回收率±3%n≧ 10)。


较宽的粒径LOD范围,适用于各种EVs

MISEV2023指南表示RPS技术可以用粒径来直接表示 LODP22),RPS 的直径LOD低至 50 nmP36)。NanoCoulter的粒径LOD50 - 250 nmC3系列小粒径芯片,适用于小EV或外泌体)或120 - 800 nmC6系列大粒径芯片,适用于大EVMV),适用于各种粒径大小的EVs,而不仅仅是外泌体。
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并且,每一份样本检测报告均出具LOD范围内的粒径分布直方图,同时也展示样本的平均粒径、集中粒径、中位粒径以及宽度系数 (Span) 等综合统计指标。


极宽的浓度LOD区间三个数量级的线性相关


MISEV2023建议在发表或公布某个样本的浓度数据时,同时附上浓度定量所采用的检测方法,以及该方法在包含所示样本浓度的某个浓度区间中,连续稀释样本的浓度线性关系数据。这一方面,NanoCouler凭借先进的绝对定量原理,以及精确的浓度检测稳定性,一经推出市场便获得广大用户的青睐。NanoCouler的浓度LOD(检测限)为5x107- 2x1011 particles/mL,同时即使是浓度的LOQ(定量限,R2> 0.999)都可以在跨三个数量级(108- 1010 particles/mL,如下图)范围中保持良好的线性相关。


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建议必要的样本检测前处理程序


粒径检测的高灵敏度(单颗粒粒径)和高分辨率(< 1 nm RPS技术的明显优势。而与此同时由于纳米孔芯片的设置,存在较大颗粒的复杂样本(如未经纯化的细胞培养上清)也就很容易发生堵塞,因此MISEV建议使用离心或过滤等分析前步骤来去除较大颗粒,同时延长纳米孔寿命。同时应明确说明任何分析前处理程序,以便这些方法更合理地同正交方法进行比较。根据参考文献,推荐用户采用以下超离或超滤步骤:

【超速离心法 (UC)

方法一:取100-150 mL新鲜或解冻的细胞悬液或尿液,使用超速离心机固定角度转子(k-factor 131,最大加速和最大减速),或4 mL血浆样本(k-factor 131,最大加速和最大减速)在4°C下以120,000 g离心2 h。在第一次离心后,用PBS重悬EV颗粒,随后在4°C继续以120,000 g在同一管中进行第二次离心2 h。除去上清液后,将EV样本收集重悬于100 µL PBS [2]。(也建议预先将细胞培养基样本以2000  g离心两次,每次10 min,用以去除细胞或较大的细胞碎片,之后用0.45 µm的滤膜过滤后再进行超离提纯,效果更佳)

方法二:分离细胞系EV时,当贴壁细胞融合度达70%以上时,收集细胞培养基。2000  g离心10 min,去除细胞和较大碎片。将样本10,000 g离心1 h,之后经0.45 µm的滤膜过滤,再100,000 g离心1.5 h后,将EV样本收集重悬于100 µL PBS [3]

【体积排阻色谱 (SEC) 与超滤】


取40-60 mL细胞悬液或尿液,使用10K分子量截留 (MWCO) 离心过滤器,根据制造商产品说明将初始体积浓缩至0.5 mL。将EV分离专用70 nm色谱柱置于室温中30 min,并用PBS清洗。将0.5 mL的样品加到色谱柱中。加入PBS洗脱140.5 mL的连续馏分。使用10K MWCO离心过滤器将EV富集组分混合并进一步浓缩至最终体积为100 µL使用[2]

空白缓冲液对照为设备标准操作流程


MISEV2023NTARPS技术要求中均提出建议“将空白缓冲液的对照纳入检测流程,来识别检测背景”。而NanoCoulter恰恰在设计之初就在每个单次样本的检测前,在程序的标准操作流程中设置了空白缓冲液(或稀释液)的对照(如下图红框),即每一次检测待测样本前,程序上必须先以空白缓冲液上样检测,并确认检测电信号基线以及排除潜在的残余杂质风险。并且,瑞芯智造团队在设备标配缓冲液中加入微量表面活性剂(不影响囊泡),从而帮助颗粒样本的分散。空白对照的设置,帮助用户严谨实验,确定空白背景是否存在干扰的同时,亦增加了芯片耗材的利用频次,极大程度地可重复使用,降低检测成本。

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MISEV2023同时也建议纳入相同浓度的样品经去污剂裂解前后的结果对比,以确定EV囊泡的存在及其纯度。例如Triton X-100(曲拉通)是一种去垢剂,可裂解EVs的膜结构。通过计算裂解前后样品的颗粒浓度比例,可实现快速EV囊泡纯度的定量检测。


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Triton X-100处理,EV颗粒数目明显下降,该样品纯度= (1-破膜后/破膜前) *100% = 87.2%


不断创新优化的设备功能


NanoCoulter系列纳米库尔特单颗粒分析设备问世之后,也在不断汲取客户建议反馈的同时,进行着持续地软硬件革新与完善。目前软件已升级至v3.2版本(产品说明详细展示了设备及软件细节),且将会继续保持以季度为单位的软件更新频率,并承诺向广大用户提供免费升级与技术支持服务,助力细胞外囊泡等纳米颗粒领域的研究不断发展。



参考文献


1、Welsh JA, Goberdhan DCI, O'Driscoll L, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024;13(2)

2、Dong L, Zieren RC, Horie K, et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. J Extracell Vesicles. 2020;10(2)


3、Li Z, Liu C, Cheng Y, et al. Cascaded microfluidic circuits for pulsatile filtration of extracellular vesicles from whole blood for early cancer diagnosis. Sci Adv. 2023;9(160)



关键词: 纳米颗粒

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