人免疫球蛋白和纳米脂质颗粒过程中中亚可见颗粒水平的评价

概要

多剂量瓶(MDV)广泛用于大多数生物制药，在使用前会被抽取到塑料注射器中。然而，使用含有硅油的塑料注射器(SO注射器)处理治疗性蛋白质时形成的可分解颗粒可能存在问题。本研究旨在评估含有人免疫球蛋白(IgG)和脂质纳米颗粒(LNPs)的MDV重新包装注射器中微粒(>1 μm)形成和积累的程度和趋势。采用光阻法(LO)和流动成像(FI)对微粒进行分析。使用SO注射器观察到的微粒数量大于不含SO注射器，并且微粒数量随着两种药物在注射器中重新包装的次数不断增加。然而，在不同品牌的SO注射器中观察到很大的差异。相比之下，使用一种不同的技术从小瓶中提取药物显著减少了微粒的数量。此外，使用集成过滤针或在配方中加入稳定剂如乙酰精氨酸和Tween 20也有助于减少颗粒的形成。

一、简介

多剂量瓶(mdv)比单剂量瓶(sdv)或预充注射器具有显著的经济和后勤优势，特别是在大规模免疫规划中。mdv是密封的容器，允许连续提取药物部分而不改变残留部分的质量，包括纯度、浓度和无菌。mdv被广泛用于Covid- 19疫苗，包括Moderna和辉瑞的疫苗。然而，已经报道了一些使用注射器将药物从mdv中重新包装的不良事件，如微生物污染、形成可见颗粒和导致免疫反应。一项研究报道了使用mdv治疗聚乙二醇肽可导致过敏反应和死亡。对于可见微粒，MDV批次中观察到的微粒数量(>1 μm)高于SDV批次，这表明过敏反应与MDV中微粒的产生有关。

使用硅油注射器(SO注射器)可增加微粒的生成已被广泛研究。研究表明，由于硅油的存在，亚可见颗粒的形成增加，而弹射或掉落注射器等机械应力进一步增加了颗粒的形成。硅油诱导的微粒可使患者发生免疫原性反应的风险较高。Chisholm等人(2016)的研究表明，蛋白质吸附的硅油微粒破坏了对重组蛋白的免疫耐受和抗体反应。其他几项研究报告称，在通过胰岛素注射器进行玻璃体内注射后，患者的玻璃体腔中存在硅油滴(或飞蚊症)，这促使美国视网膜专家协会发布了关于胰岛素注射器中硅油滴的警报。预充注射器或针管产品可以替代塑料注射器。然而，据报道，主因是在包装从小瓶切换到预充注射器的情况下形成了蛋白质聚集。说得更加具体的是蛋白质暴露在某些产品中的硅油中，否则在小瓶中可能不会遇到。

图1所示。图示演示了从小瓶中提取药物的常规逐步指导(称为“来回运动”)

尽管有关于SO注射器不良反应的报道，但在大多数临床或非临床环境中没有采取缓解措施。此外，MDV的剂量大小为每瓶2至20剂，大多数儿童免疫接种为每瓶10或20剂，这可能会增加硅油从注射器渗入到小瓶的风险。一项研究报道，将贝伐珠单抗从小瓶重新包装到SO注射器中导致药物浓度下降10%，微米级蛋白颗粒(>1 μm)大幅增加，随后患者眼压升高。另一项来自复合药房的重新包装贝伐珠单抗样本的研究表明，硅油是颗粒数量增加的病原体。因此，了解与使用mdv和SO注射器相关的风险至关重要。

考虑到这些问题，本研究旨在量化由于使用SO注射器而在MDV中形成的亚可见颗粒及其积累趋势。我们模仿了在临床环境中从小瓶中取出药物的技术，这些技术也在几个指南中提供(图1)。以肌内γ-球蛋白(IgG)和空脂质纳米颗粒(LNPs)为模型药物。每个小瓶中的样品被重新包装成8个不同品牌的注射器，而只研究了、第四、第七和第八支注射器。光阻法(LO)测定颗粒数。虽然LO通常用于计算亚可见颗粒，但它不能计算半透明颗粒，并且可能错误标记颗粒大小。因此，将流式成像(FI)技术与LO技术结合使用，以确定颗粒计数并区分颗粒的形态。通过FT-IR和评估其重量差来确认硅油的存在。

二、材料与方法

2.1 材料和样品制备

编号:020A19001, Gamma Globulin)，由165 mg/mL人源IgG、22.5 mg/mL甘氨酸和5mg /mL氯化钠组成，pH值为6.8，购自GC Biopharma(京畿道，韩国)。IgG用相同的缓冲液稀释至10 mg/mL, LNP在pH 7.4的缓冲液中稀释40倍。LNP载体(以下简称LNP)由脂质胆固醇、peg2000神经酰胺、阳离子脂质和1,2-二硬脂酰- asn -甘油-3-磷酸胆碱(dsc)组成，由EnhancedBio Inc.(首尔，韩国)提供。注射用水(WFI)购自JW制药公司(韩国首尔)，异丙醇(IPA)购自大田化学金属有限公司(韩国京畿道)。n - α-乙酰- l-精氨酸和Tween™20 Surfact-Amps™洗涤剂溶液(Tween 20)分别购自Sigma-Aldrich (St. Louis, LO, USA)和Thermo Fisher Scientific (Cleveland, OH, USA)。

比较三种不同品牌的注射器:(1)kovax -注射器1 mL，可拆卸26号针头(so -注射器1;韩国疫苗有限公司，京畿道，韩国)，(2)b1ml带Luer-lok™尖端的注射器(so -注射器2;Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)和(3)HENKE-JECT^®两部分一次性注射器1ml不含硅油(SO-free注射器)。所有的注射器都在有效期内使用过。KOVAX-NEEDLE 25G (25G针头;除了“过滤器针头测试”外，研究中所有3支注射器都使用了韩国疫苗有限公司(Korea Vaccine Co.，京畿道，Korea京畿道)，该测试使用了胰岛素/结核菌素注射器(Ezfilter^®1ml, Donghwa C&M)的可拆卸18号针头和5 μm针头过滤器。(首尔，韩国)。针头从原来的注射器中分离出来使用。对于MDV，使用高压灭菌后的5ml玻璃小瓶(BT134005, Hwankyung Tech, Seoul, Korea)，在重新包装前用20mm橡胶塞和铝压盖将其封闭。对于再包装注射器，8支注射器从5 mL装药的小瓶中取出0.5 mL (n = 3)，第1、4、7、8支注射器用于颗粒分析。

图2所示。(a)研究中使用的代表性塑料注射器和针头，(b)使用WFI和IPA从每种类型的20支注射器中提取的干燥残留物的重量，以及(c)从塑料注射器中提取的残留物的叠加FT-IR光谱。

2.2 衰减全反射FT-IR光谱

使用Nicolet iS5分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)配备iD5钻石衰减全反射附件来鉴定硅油。在室温下测量红外光谱。为了从注射器中提取硅油，每种型号各取50支注射器，先充入0.5 mL的IPA，倒置10次，然后将内容物释放到50 mL的烧杯中。IPA在100°C下干燥，直到获得恒定重量。提取物用100 μL异丙醇重溶。将制备好的样品取5 μL置于结晶板上干燥5min，在4000 cm􀀀1 ~ 400 cm􀀀1范围内记录64幅干涉图，分辨率为4 cm􀀀1。采用Nicolet Omnic软件8.2.387对样品进行光谱分析。

2.3 硅油含量

为了测定塑料注射器中硅油(即可浸出的)的相对含量，20支注射器各充入0.5 mL WFI和IPA。填充后，注射器用注射器盖密封并倒置10次，然后将内容物释放到预称重的玻璃小瓶中。将小瓶中的溶剂在100℃下完全干燥，直到获得恒定重量，并记录干燥提取物的重量。

2.4 光阻法

使用HIAC 9703+液体粒子计数器(Beckman-Coulter, Brea, CA, USA)获得颗粒浓度。在每次分析之前，用0.2 μm minusart^®NML无表面活性剂醋酸纤维素注射器过滤器(Sartorius AG, Goettingen，德国)过滤的去离子水冲洗流体路径，然后测量相同的颗粒计数以确认检测器的清洁度。<10个粒子(p)/mL被认为是可接受的背景值。每个样品测量5次，每次测量体积为0.1 mL。使用3个结果的平均值(即删除次和最后一次检测的结果)来计算平均值和标准差。通过仪器自带的PhamSpec软件(版本为3.5.32)获得粒径>2 μm、>5 μm、>10 μm和>25 μm的颗粒。数据依次排列在2 ~ 10 μm、10 ~ 25 μm和>25 μm的尺寸范围内。

2.5 流式成像法

采用配备10倍放大镜的Flowcam 8100 (Fluid-imaging Technologies, ME, USA)对颗粒浓度(p/mL)及其形态进行分析。在每次样品测量之前，测量去离子水以确认流体路径和流池的清洁度。颗粒浓度< 50 p/mL被认为是可接受的背景值。在所有的测量中，使用未经稀释的0.5 mL样品溶液，以避免形成的颗粒解离(数据未显示)，0.1 mL的样品溶液以0.1 mL/min的流速测量5次。和第五项分析从数据收集中删除。基于ABD的颗粒粒径范围为1 ~ 10 μm、10 ~ 25 μm和>25 μm。通过3个连续测量和3个单独的小瓶计算平均值和标准差。使用仪器自带的VisualSpreadsheet软件(4.17.14版本)进行数据分析。

2.6 统计数据

实验分三次进行，使用Excel程序计算平均值和标准差。

2.7 统计分析

在Microsoft Excel中使用Student’s t-test比较LO和FI的结果。每次分析的统计学显著性用单尾p值表示，p值分为<0.05(*)、<0.01(**)和<0.001(***)三类。所有数据均以均值和标准差表示(n = 9)。

图3所示。在WFI上通过LO(上)和FI(下)进行颗粒分析，从小瓶中来回移动重新包装在塑料注射器中。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示重新包装的注射器中颗粒浓度与之前的注射器相比增加有统计学意义(重新包装的注射器#4 >重新包装的注射器#1;重新包装的注射器#7 >重新包装的注射器#4;重新包装注射器#8 >重新包装注射器#7)

三、结果与讨论

注射器内硅油含量

图2a显示了不同类型的含硅油和不含硅油的注射器以及实验中使用的针头。在之前的研究中，我们使用IPA对SO注射器中的硅油残留物进行提取和定量。由于大多数药物配方都是基于水性溶剂，与IPA一起，WFI还用于相对量化塑料注射器的可浸出水平。

图2b显示了使用IPA和WFI从每种类型的20支注射器中提取的干燥残留物的重量。由于溶解度的差异，ipa提取残留物的数量可能更高。如图所示，so -注射器1产生的残留量最多(20支注射器的平均值:WFI为1.20 mg, IPA为20.66 mg)，其次是so -注射器2(20支注射器的平均值:WFI为0.68 mg, IPA为5.27 mg)，这表明不同供应商的注射器中可浸出水平差异很大。进一步用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对萃取物进行分析，以确定残留物中存在硅油。如图2c所示的FT-IR光谱显示，硅油在1260 cm􀀀1 (CH3在Si-CH3中的弯曲振动)、1090 cm􀀀1、1020 cm􀀀1 (Si-O-Si的不对称拉伸振动)和800 cm􀀀1 (Si-C在Si-CH3中的拉伸振动)处有明显的吸收带[31,32]。此外，FT-IR上的吸光度与残留物的数量相关，如图2c所示，进一步证实残留物主要是硅油。有趣的是，尽管在FT-IR光谱中没有观察到硅油相关的峰，但在无so注射器中也发现了少量残留(WFI中平均0.07 mg, IPA中平均0.26 mg)。在这种情况下，检测到酰胺在3184和3375 cm􀀀1处的N-H拉伸峰(数据未显示)和在1631和1557 cm􀀀1处的C - - 0拉伸峰，表明无so注射器提取物中使用的油酰胺型润滑剂存在。

so -注射器1和so -注射器2的硅油每面积重量分别为0.08 mg/cm2和0.02 mg/cm2，均在ISO 7886- 1:2017的一般限值(0.25 mg/cm2)内。相比之下，使用可以完全溶解硅油的乙酸乙酯可以产生更大的量。然而，我们在本研究中没有使用有机溶剂，因为它也会提取双酚A，并且会增加so -注射器2中提取物的重量。因此，即使是轻微的搅拌，如倾斜注射器几次，也会导致硅油从充满WFI的注射器释放到MDV中。我们进行了进一步的研究，以评估有和没有模型药物的SO注射器产生的mdv中的颗粒积累程度。

图4所示。10 mg/mL IgG，重新包装在塑料注射器中(a)， (b)无来回运动。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示重新包装的注射器中颗粒浓度与之前的注射器相比增加有统计学意义(重新包装的注射器#4 >重新包装的注射器#1;重新包装的注射器#7 >重新包装的注射器#4;重新包装注射器#8 >重新包装注射器#7)

再包装注射器中WFI的颗粒分析

硅油在注射器内的释放及其对生物药品稳定性和有效性的影响以及免疫原性风险在过去20年中已经有报道。如图1所示，将药品取出的方法可能会增加污染瓶中剩余药品的风险。这将带来更大的mdv风险，因为通过每次注射器制备引入小瓶的任何颗粒都可能被携带到连续的注射器上。为了证实颗粒数量随着注射器制备而增加的假设，最初进行了预测试，将小瓶中的WFI重新包装到8个带硅油和不带硅油的注射器中。然后使用LO和FI评估注射器的颗粒计数。

图3显示了用LO和FI测定的瓶子中再包装注射器中WFI的颗粒浓度(p/mL)。结果表明，LO和FI的颗粒浓度相差大于10倍。这种差异已被广泛报道，并归因于LO检测光学对比度低和/或折射率与介质相似的颗粒的能力有限。与标准聚苯乙烯珠(折射率为1.6)不同，硅油(1.405)和水(1.333)的折射率差异很小，可能限制了LO对硅油颗粒的检测。然而，LO和FI识别的颗粒尺寸在1- 25 μm范围内，在1-或2-10 μm范围内颗粒负荷较高。这一观察结果与之前的一项研究一致，该研究报告在2-8◦C下储存90天后，注射器中1-10 μm范围内产生了更多的硅油颗粒。相应的，LO检测到的>25 μm的颗粒数量可以忽略不计，而FI没有检测到这样的颗粒。

图3显示了基于注射器类型的结果评价，可见so -注射器1的颗粒计数最高，其次是so -注射器2，与各自注射器中的硅油含量相当(图2b)。在无so注射器中也检测到颗粒，尽管相对较少。图2c所示的FT-IR数据得到了先前研究的证实，表明残留物可能是从无so注射器的内表面释放出来的油酰胺。此外，从LO和FI获得的数据显示，无论注射器类型如何，随着重新包装计数的增加，颗粒积累的模式相似。在所有类型的注射器中，颗粒浓度随每次重新包装而增加，这支持了我们的假设。最初，在1 - 10 μm范围内，重新包装的so -注射器1、so -注射器2和无so -注射器1中的颗粒浓度(即按FI计算)分别为1246 p/mL、1038 p/mL和874 p/mL，在重新包装的注射器8中分别增加到9830 p/mL、5744 p/mL和3458 p/mL。结果表明，高变异性的管理注射器和一个令人惊讶的结果，颗粒浓度的增加取决于重新包装注射器的数量。

此外，每次重新包装时颗粒浓度的增加也提出了在临床环境中通常使用的提取技术(来回移动)的问题(图1)。从小瓶中提取药品时经常会产生气泡。在步骤4中，轻弹注射器使气泡向注射器尖端移动会引起机械应力，从而导致硅油或其他润滑剂从内桶中迁移[16]。此外，推动柱塞将气泡释放到瓶中，将释放的润滑剂引入瓶中。Melo等人的研究报道，轻弹注射器引起的SO液滴水平升高可能导致眼内注射患者不良反应增加。图3所示的结果表明，在含润滑剂注射器中使用前后运动和轻弹会导致每次重新包装时MDV中的颗粒(可浸出)浓度增加，这可能与药物相互作用，影响药物的疗效和稳定性。

图5所示。用FI对10 mg/mL IgG进行颗粒分析，重新包装在塑料注射器中(a)， (b)没有来回运动。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示重新包装的注射器中颗粒浓度与之前的注射器相比增加有统计学意义(重新包装的注射器#4 >重新包装的注射器#1;重新包装的注射器#7 >重新包装的注射器#4;重新包装注射器#8 >重新包装注射器#7)

再包装注射器中药物颗粒分析:前后运动的影响

我们以10 mg/mL IgG为模型药物，考察硅油和来回法对蛋白治疗的影响。图4和图5分别显示了使用LO和FI分析的再包装注射器的颗粒分析。当在小瓶中存在IgG的情况下进行前后移动时，与WFI相比，在所有尺寸范围内都观察到颗粒浓度的显著增加。在2个品牌的SO注射器中，每次重新包装都有明显的增加趋势，表明所产生的微粒的积累和转移。与WFI样品(图3)相比，重新包装的注射器#8中，so -注射器1、so -注射器2和无so -注射器的颗粒计数分别比LO观察的增加了5倍、6倍和3倍(图4a)，比FI观察的增加了11倍、4倍和3倍(图5a)。结果表明，与不使用SO的注射器相比，使用SO的注射器颗粒浓度增加的倾向更高，表明硅油是颗粒形成的原因。此外，还观察了不同品牌SO注射器颗粒浓度的差异。造成差异的原因可以解释为从注射器中释放的硅油量不同(图2b)，可能在使用so -注射器1时提供了更多的形成蛋白膜和颗粒的位点(图3、4a和5a)。然而，无论不同品牌，两种SO注射器均存在>25 μm的颗粒，而在WFI中，这一差异不显著。颗粒的代表性FI图像显示，在IgG存在的情况下，硅油与吸附的蛋白质形成了一个复合物，形成了尺寸>25 μm的更大的亚可见颗粒(图6)。此外，药物介质对过程中微粒的形成也有显著影响。甘氨酸在本研究中作为IgG的赋形剂，通过减少界面吸附的有效性来增加蛋白质分子展开的能量，这可能是在SO存在下形成微粒的主要途径，使蛋白质分子容易被吸附到SO表面。先前的研究表明，在注射筒处的硅油表面可以形成蛋白质层。初级层是不可逆结合，而随后的层是可逆结合，并且容易被柱塞头的扫力解吸，释放微粒。此外，几项搅拌研究表明，硅油颗粒从注射器筒中释放出来，为其表面形成蛋白质膜提供了一个表面，并增加了颗粒浓度。将注射器镀硅主要是为了减小柱塞与筒体内表面之间的滑动力。由于硅油已被证明会增加注射器中的微粒浓度，具有等效断裂损失和滑动力的非硅化材料可能是缓解此类问题的替代品。

虽然用不含SO的注射器代替SO注射器减少了颗粒负荷，但颗粒仍在生成，并且颗粒浓度随着重新包装的增加而增加的趋势持续存在，这意味着它们与高蛋白浓度的产品不相容。进行了进一步的调查，以确定不同的提取技术是否可以防止不可见颗粒的积累和携带到连续的注射器中。在步骤4(图1)中轻弹注射器使气泡移动到喷嘴顶部后，注射器从小瓶中取出。然后，当推动柱塞时，气泡被释放到空气中，直到药物溶液暴露在针头的末端。然后将注射器插入小瓶中以调整所需的药物溶液体积。因此，在重新包装的注射器#8中，观察到颗粒计数显著减少，分别由LO和FI检测到约2至4倍减少(图4b)和4至20倍减少(图5b)。此外，当改变前后运动(图4b)时，重新包装的注射器#8与无so注射器(图4a)之间的颗粒浓度差异(几乎是10倍)最小(图4a)。这一结果突出了指南中提供的提取技术和防止硅油颗粒积聚方法的缺点。

图6所示。在10 mg/mL IgG中观察到的颗粒的代表性FI图像，重新包装在含有SO的塑料注射器中(右)，没有来回运动(左)

此前已有研究报道硅油对蛋白质稳定性的影响。然而，其在用于核酸药物递送的LNP制剂中的作用尚未研究。考虑到最近LNP配方的流行以及MDVs用于Covid-19疫苗，研究药物稳定性的各个方面对于确保患者安全给药至关重要。在LNP上使用相同的程序重复测试。然而，由于FI结果似乎比LO更敏感，因此仅包括FI数据以供进一步讨论。图7a和b显示了使用FI分析的重新包装LNP的颗粒浓度。在连续重新包装的注射器中，颗粒浓度随前后运动呈增加趋势(图7a)。当避免前后运动(图7b)时，颗粒计数没有明显增加，不同类型注射器之间的差异较小。

与硅油诱导的IgG颗粒积聚不同，在LNPs的代表性FI图像中区分硅油颗粒是具有挑战性的(图8)。通常，硅油颗粒是根据其圆形和中空度与其他颗粒进行光学区分的;硅油诱导颗粒的核心更亮，核心和边缘之间的对比度也很高。然而，LNP样品中的此类颗粒很少(图8)。这可以推测，因为LNP与SO相互作用或团聚产生了比蛋白质颗粒更致密、折射率更高的颗粒。我们没有进行进一步的表征，因为目前的研究旨在证明在给药前，重新包装的标签外使用SO注射器与多用途小瓶中的药物质量不同。同样，在重新包装过程中尽量减少来回运动可以减少小瓶中的颗粒积聚并携带到注射器中。

图9所示。用FI对(a) 10mg /mL IgG进行颗粒分析，用过滤器集成针重新包装在塑料注射器中(注射器中未使用过滤针的数据见图3)，(b) 10mg /mL IgG加入添加剂后重新包装在塑料注射器中，(c) LNP加入添加剂后重新包装在塑料注射器中。所有样品都被重新包装，前后移动。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示带滤芯针与不带添加剂样品的差异有统计学意义

过滤器集成针在重新包装中的影响

美国卫生系统协会建议在使用单剂量安瓿时使用5 μm过滤器集成针头，以降低将玻璃颗粒注射到患者体内的风险。一些研究表明，集成过滤器的针头可以有效地减少玻璃颗粒污染。在线过滤器也被用于静脉输液，以防止微颗粒成分进入血液循环[59]。在之前的一项研究中，与不使用过滤器的针头与SO注射器一起使用相比，使用过滤器集成针头可以降低IgG制剂中的颗粒浓度。在此基础上，评价了5 μm过滤集成针对含IgG的mdv再包装的效果。使用过滤器集成针降低了所有粒径范围内的颗粒浓度(图9a)。使用FI测定，重新包装的注射器#8中粒径为1 - 10 μm的颗粒数量在so -注射器1中从111,414 p/mL减少到95,614 p/mL，在so -注射器2中从23,238 p/mL减少到15,524 p/mL。在粒径> 10 μm范围内，使用该过滤器可降低颗粒浓度。但粒径>5 μm的颗粒仍存在，且其数量高于消除前后运动后的颗粒。这可能是由于硅油和/或诱导颗粒的灵活性，可以通过过滤膜;此外，在分析之前没有更换过滤器。然而，数据表明，过滤器集成针头可以通过减少小瓶中的积聚来降低携带到连续注射器中的微粒水平，特别是在so注射器2中。

吐温20和乙酰精氨酸对再包装的影响

已知非离子表面活性剂，如聚山梨酯，可以降低单克隆抗体的界面应力，从而最大限度地减少硅油存在下的颗粒形成。表面活性剂浓度大于其临界胶束浓度(CMC)已被证明在将蛋白质分子从界面上取代方面特别有效[62]。然而，SO的存在进一步增加了蛋白质吸附的界面面积，因此需要使用更多的表面活性剂来减少界面吸附。此外，150 mM的n - α-乙酰- l-精氨酸(acetyl- l-arginine，乙酰精氨酸)被报道在硅油存在下抑制搅拌应力中IgG的亚可见颗粒形成。因此，在本研究中，在IgG和LNP中加入10× 20和150 mM乙酰精氨酸cmc，比较它们在重新包装到SO注射器时减少颗粒形成的效果。当添加到IgG中时，Tween 20和乙酰精氨酸在所有尺寸范围内的颗粒浓度都有所降低(图4a和5a与图9b相比)。在SO注射器1中，与重新包装的注射器7相比，颗粒浓度的降低是显著的，这表明在注射器制备过程中，浸出硅油表面的蛋白质膜形成受到抑制。

相比之下，LO和FI结果表明，添加Tween 20后，1-10 μm的IgG颗粒数量相对较多。大多数与硅油相关的颗粒(在WFI中)的大小在1-10 μm之间(图2)。考虑到Tween 20由于其高浓度会影响IgG的高阶结构，它可能导致IgG的Fab区发生化学位移，而乙酰精氨酸对其构象的影响最小，只是阻止疏水相互作用，导致蛋白质-蛋白质相互作用减少。然而，与乙酰精氨酸相比，Tween 20在> 10 μm的尺寸范围内产生了更好的颗粒还原效果，这表明Tween 20对空气-水或其他界面应力的主要影响，减少了更大颗粒的形成。总体而言，与使用过滤器集成针头相比，使用添加剂对重新包装注射器中硅油诱导颗粒的减少效果更好(图9a与图9b)。同样，在重新包装LNP时，Tween 20和乙酰精氨酸也能有效地减少所有尺寸范围内的颗粒(图9c)。因此，在将药物投放市场之前，还应考虑最大限度地减少超说明书使用注射器中的颗粒形成，并需要优化制备指南，以确保给药前的药物质量。

本研究旨在评估so注射器重复使用MDV时颗粒蓄积量。WFI、人源IgG和LNP三种溶液的颗粒水平均升高，尤其高于无so的注射器。其浓度和大小可能因生物药品及其制剂的物理特性而异。考虑到wfi填充的MDV中颗粒浓度呈持续增加的趋势(图3)，硅油或微粒的积累会对下一次重新包装的注射器产生影响。另一方面，本研究的局限性在于只使用了LNP载体。因此，由于LNP与塑料注射器中硅油的相互作用可能与COVID-19疫苗等商业产品不同，因此没有进一步表征LNP与硅油的相互作用。然而，硅油在MDV中积累的影响绝不能被低估，例如，在使用低死区注射器(LDS)时，通过清除小瓶中的残留物来提供额外的剂量。

结论

本研究表明，每次连续注射器从多用途小瓶中提取硅油诱导的亚可见颗粒增加。改变停药技术减少了微颗粒的数量，提示有必要修改制备指南。此外，使用过滤器集成针或稳定剂也减少了颗粒的形成。颗粒浓度可能与市场上的“真正”药品不同。然而，考虑到在生物制药中越来越多地使用耐多药，认识到与亚可见颗粒的产生及其在小瓶中的积累有关的风险以及所使用的材料类型和技术的影响至关重要。