外泌体纯度鉴定—纳米库尔特电学篇

   说到外泌体的纯度，想必让很多该领域的从业者也比较头疼。外泌体主要由各类细胞分泌，存在于各种体液中，由于形成环境的复杂性，再加上外泌体在体液里含量不高，导致其存在天然的提取难度，往往费尽力气提取到的样品，里面的物质有多少是真正的外泌体还很难说，现有方法如WB、电镜等常见的检测手段虽然能够在一定程度上对外泌体进行鉴定，但都存在各自的局限，WB虽然能够检测外泌体的标志性蛋白，但耗时长，也分辨不了游离的蛋白；电镜可以直观的看见外泌体，但实在缺乏统计性，而且设备过于昂贵，制样复杂，这些都无疑加大了外泌体的研究难度。

不过我们可以将多种方法结合使用，互相验证，以此来确定外泌体的纯度信息，本篇我们将用BCA和Triton（曲拉通）X-100结合瑞芯智造的纳米库尔特粒度仪（Nanocoulter）对外泌体的纯度进行鉴定。

我们将A和B两种不同的外泌体样品进行相同倍数的稀释，先用对蛋白耐受性较低的芯片测试，结果显示A样品可以正常测试，但B样品测试过程中出现异常，我们由此初步判断A样品蛋白浓度低于B样品；然后再用蛋白高耐受芯片重复测试，得到A、B两种样品的颗粒浓度，并通过BCA测定两种样品的蛋白含量，以颗粒浓度值/蛋白浓度值来反映外泌体样品的纯度（如下图所示。）。

图1：纳米库尔特粒度仪（瑞芯智造）用不同耐受性芯片测试外泌体

这种采用与BCA蛋白浓度测试结合的方法能够对样品浓度进行快速检测，可以在一定程度上反映外泌体样品的纯度，但这种方法精确度不是很高，因为BCA检测到的外泌体样品中的蛋白含量跟真正的外泌体膜蛋白的含量是存在差异的，在样品中游离的非膜蛋白也会被检测到，所以实际检测到的蛋白浓度比起真正外泌体膜蛋白浓度是要偏高的，该方法适用于采用相同手段获得的外泌体样品纯度的快速对比检验。

Triton（曲拉通）X-100是一种非离子表面活性剂，低浓度可以增加细胞膜通透性，高浓度可以裂解细胞，而外泌体的膜结构与细胞别无二致，所以可以用TritonX-100裂解外泌体，通过检测裂解前后的样品颗粒浓度变化来鉴定其纯度。具体实验过程如下；将一外泌体样本稀释100倍后分成等量的两份，将其中一份加入一定比例（须确保能够裂解所有外泌体）的TritonX-100试剂，然后将两份样品在相同条件下充分混匀以全部裂解外泌体，之后同时开始测试，最终结果

如下图所示：

图2：纳米库尔特粒度仪（瑞芯智造）测试TritonX-100裂解外泌体前后浓度变化

从上面的数据中可以看出破膜前后样品浓度发生了将近10倍的变化，但是粒径的分布情况却比较类似，说明其实样品里面非外泌体颗粒和真正的外泌体粒径分布很接近，通常采用离心分离或者尺寸排阻类方法提取外泌体会比较容易出现这种情况，最后计算得出该样品的纯度为87.2%，该方法操作简单、精确度高、检测速度快，是一种不错的外泌体纯度检验方法。

纳米库尔特粒度仪应用的RPS原理又称电阻感应脉冲法，电解质溶液中的颗粒通过纳米孔时，在恒电流设计的电路中，导致电极间电阻产生瞬时变化从而产生电脉冲，电脉冲幅度与粒径成正比。作为电学检测原理方法，RPS 不同于光学检测方法,如动态光散射(DLS)、纳米粒子示踪(NTA)、纳米流式，与样本光学性质无关。纳米库尔特粒度仪可在单颗粒水平实现纳米颗粒的多参数表征，粒径测量精度可媲美电镜，3-5min就可精准得到样品完整，真实的粒径分布。

得益于纳米库尔特粒度仪的高精度、高分辨率和检测速度，我们能够通过这两种简便快速的方法测试外泌体的纯度，为这个难题提供了行之有效的解决办法，当然，瑞芯智造仍会致力于打造检测更精确、应用更全面的纳米粒度仪，我们还会不断探索研究，以期能做到更优更好，希望能为外泌体领域的研究发展提供更强的助力。