关于胶乳微球表征，你知道多少？

     免疫比浊法是目前非常主流的一种免疫检测方法，其基本原理为：抗原抗体在缓冲液中特异性结合形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，透光率下降。在一定的比例范围内，反应液的浊度和抗原抗体的量呈线性相关关系，从而得到样液中抗原的含量。

免疫比浊中抗体的载体主要是胶乳微球，常见的胶乳微球由苯乙烯及相应功能单体通过乳液聚合法制得，粒径范围为50nm至400nm的一种纳米材料。胶乳微球的粒径会影响免疫比浊灵敏度大小、抗体投入量多少、包被微球的抗体活性及微球本身稳定性等，因此精准监控胶乳微球的粒径分布情况，团聚、分散等状态也成为微球的生产包被工艺流程中的重难点。

免疫比浊试剂的研发过程中，需要对裸露的胶乳微球进行包被以及封闭操作，而在微球包被、封闭结束后，通常需要通过高速离心的方法去除多余的蛋白和封闭剂，在离心之后又需要超声使微球均匀悬浮在液体当中。令人头疼的是，超声不足，微球不能充分分散；超声过度，可能造成抗体或封闭剂从微球表面脱落，容易造成微球聚集、沉淀。

微球颗粒越大、浓度越高吸光度也会增大，所以经常会用紫外分光光度法测量微球的吸光度来反应微球样本的团聚或者浓度情况。笔者通过紫外分光光度法研究了150nm微球包被前后的变化情况，检测了包被前的裸露150nm微球的吸光度为0.68A，包被后微球吸光度为1.11A，就说明包被后样本团聚严重。超声分散后，检测微球吸光度为0.60A，此时微球吸光度与裸微球的吸光度相近，说明微球已超声分散好，可以用于后续实验。

但发现后续实验结果与预期有较大的偏差。猜想虽然包被后超声的微球吸光度与裸微球的吸光度相近，但微球的状态很可能不一样，而紫外分光光度计无法检测到这样的细节，分辨率较低。因此需要一款高精度的纳米颗粒表征仪器，目前高精度的纳米单颗粒表征方法有纳米粒子示踪（NTA）、纳米流式、纳米库尔特粒度仪（Nanocoulter），但是前两种方法都是光学方法，易受样本的光学性质影响。Nanocoulter运用RPS（电阻感应脉冲）原理，RPS作为电学的检测方法，不存在大小颗粒互相影响的现象，是真正意义上的单颗粒检测方法，反映样本最真实的粒径分布。而且不受样本吸光度、折光率影响，与样本光学性质无关，拥有非常高的分辨率，可以精确看到样本团聚等细微变化。

笔者选用了Nanocoulter检测微球包被过程中各步骤的颗粒浓度。数据显示150nm裸微球浓度为5.338E+11（Particles/mL），且粒径集中在150nm处，样本中只有微量团聚体，微球的均一性很好；包被后的微球，样本中的团聚明显增多，与吸光度反映一致；而包被微球超声后，浓度为4.602E+11（Particles/mL），相比裸微球，包被后超声微球浓度明显下降，样本损失了13.8%。而且超声后的微球并没有分散好，样本中还有10%左右的团聚颗粒。

至此，笔者确定先前引起吸光度降低的原因，就是因为工艺过程中微球的损失导致。另外，超声后吸光度虽降低，但微球中其实还是有部分团聚体，这种情况是分光光度计无法准确分析的。甚至因为损失，分光光度计还会在遇见团聚体时给出“分散较好”的误导信息！但实际上，微球吸光度一致时，微球的团聚情况也可能不同。

总结

纳米库尔特粒度仪（电阻法RPS）在免疫比浊试剂生产研发中有明显优势：

1. 粒径测量媲美电镜，可以准确展示微球的粒径分布，分析团聚情况；

2. 精准的浓度测量，分析微球包被工艺当中的损失及分散情况；

3. 真正意义上的单颗粒检测，展示样本的原始面貌。