外泌体的结构功能和外泌体分离方法

 外泌体通常被认为是细胞间信号分子，包含许多蛋白质、核酸、细胞因子、转录因子和其他细胞来源的颗粒。外泌体不仅可以向局部环境传递信息，还可以向距离很远的细胞和组织传递信息。这可能作为一般信号和通信通路，但也可能参与致癌基因扩散和恶性肿瘤进一步恶化。迄今为止，已证实外泌体存在于体液中，例如羊水、血清、母乳、附睾液、唾液、尿液、腹水和胸腔积液、支气管肺泡灌洗液、滑液和体外细胞培养上清液中 。细胞排出的外泌体也可作为去除不必要的蛋白质和核酸的一种方式，例如，在细胞成熟（网织红细胞）或排泄系统（肾的内脏和小管 ）期间的外泌体。

     为了正确使用外泌体作为 DDS，我们必须考虑外泌体的成分和它们的形成途径。然后，还应描述外泌体亲和力和细胞摄取的特征。外泌体载体表现出不同的目的和功能，这要归功于外泌体作为基本的转运体本身就具有出色的特性。这可以用于细胞靶向，也可以作为药物的额外增强。迄今为止，ExoCarta 在外泌体中发现了大约 10,000 种蛋白质、3500 种 mRNA 和超过 1100 种不同的脂质。 对于系统审查，出现了许多很棒的数据库，例如Vesiclepedia和 ExoCarta，其中描述了外泌体分离程序和来源以及已识别的载体.
     外泌体蛋白质特征是:膜结合四跨膜蛋白（CD9、CD63、 CD81 和 CD82），以及常规用于分离的 EpCAM 和 Rab5 。其他蛋白质是受体（CD46 和 CD55）、热休克蛋白（HSP ；Hsc70、Hsp70 和 Hsp90）、参与外泌体形成的蛋白质（ Alix、TSG101）和负责融合和转运的膜蛋白（GTP 酶、膜联蛋白和 flotillin；ATP7A、ATP7B、MRP2  、SLC1A4 、SLC16A1 和 CLIC1)等。使用 ELISA法检测这些标记蛋白可以用于确认外泌体的存在。
     也有相关研究称外泌体含有其他颗粒，如胆固醇（B 淋巴细胞来源）、鞘脂、磷酸甘油酯和神经酰胺等。外泌体还运输形态发生素（Hedgehog、 Wingless 和 Wingless-like），参与黑腹果蝇所描述的组织模式发育。
         核酸是在外泌体中发现的另一组主要颗粒，即 DNA 和 RNA，它们可以在细胞中发挥功能作用。在源自小鼠和人类肥大细胞的外泌体中发现了约 1300 种 mRNA、121 种 miRNA 和 >100 种小 RNA，但未检测到 DNA 和 rRNA 。 在外泌体中发现的其他 miRNA 是 lin-4 和 let-7 ，以及母乳中的 miR-181a 和 miR-155。

一些外泌体 miRNA 可用作诊断中的生物标志物（ 表 2）。

小鼠外泌体对人类细胞的刺激可以导致人类细胞中小鼠蛋白质的合成。此外，外泌体和受体细胞的 mRNA 谱不同，表明 mRNA 被主动分选为 MVB。
外泌体的分离方法
目前，有许多可用的外泌体分离方法（ 表 1）。比较传统的外泌体分离方法是超速离心，许多人将其视为金标准。其他技术主要基于大小排阻或抗体介导的标记外泌体分离。每种分离方法在纯度、数量、效率和通量方面都不同。超速离心法分离法 的缺点是外泌体结构容易发生改变，造成外泌体的结构不一致性甚至会导致外泌体受损。
表 1. 外泌体分离方法。

1.超速离心法：
   超速离心基于颗粒的大小（重量）及其在离心力（100,000–110,000× g）下的离心沉降。至于去除的细胞碎片和不需要的颗粒可以通过称为差速离心的几步慢速离心来获得。外泌体的纯化可以采用蔗糖梯度密度离心纯化法：即：在蔗糖梯度 (1.13–1.19 g/mL) 或缓冲液中进行，以实现更高的富集、产量和纯度增加。 
2.超滤法：
   超滤法使用的是微孔过滤器；因此，较大的颗粒将从滤液中排除。它可以与离心结合使用，通过初步去除细胞碎片等大颗粒来加速外泌体的纯化。不过使用此方法需要防止孔隙堵，不适合大规模的样本处理。
3.尺寸排阻层析法
    尺寸排阻层析法也被称为凝胶过滤层析法，这种方法是基于凝胶孔的大小和外泌体的大小，大于凝胶孔径的颗粒被洗脱；反之，小于凝胶孔径的颗粒将被抑制。凝胶过滤层析 分离法总体上能获得较高的纯度和产量。建议与超滤相结合，这种方法可提供更少的蛋白质污染和更高的外泌体回收率。 凝胶过滤层析分离法的缺点是凝胶的成本过高。
4.沉淀分离方法：
   基于聚合物的沉淀分离方法是利用超亲水聚合物来增强小尺寸颗粒（如外泌体）的沉淀。聚乙二醇的常用浓度在 8% 到 15% 之间变化。使用这种方法，将含有外泌体的溶液与聚合物一起孵育过夜，并在约 10,000× g下进一步离心。
5.免疫学分离方法
   免疫学分离法是利用受位于外泌体膜中的选定蛋白质标记物影响的抗体对外泌体进行标记。这些标记的外泌体可以进一步轻松处理和纯化，例如，使用微芯片或磁珠。磁分离后，外泌体被纯化，磁珠被溶解和去除。通过这种简单快速的方法，就可以获得较高纯度提取物，但不会分离出缺乏磁性标记抗体识别的表面标记的外泌体，这可能导致外泌体池表现效果 不佳。这种方法虽然既省时又直接，输出纯度较高，但也需要较为昂贵的试剂。
6.亲和层析分离法
在亲和层析分离法方面，主要使用凝集素和合成 Vn (venceremin) 肽。凝集素将结合存在于外泌体表面的糖基化蛋白质，从而使 外泌体沉淀。Vn 肽分离技术基于其对含有 HSP 的细胞外颗粒的高亲和力。然而，这种方法比较容易使提取物被膜表面上含有上述标记物的细胞和其他颗粒污染。
7.微流控分离法
  微流控分离法主要是在微芯片上进行的，这里我们需要提及的是，微流控分离法法可用于外泌体分离（免疫结合和磁结合、过滤），效率相对较高（约 90%）。
8.FFF分离法
  FFF 目前是一种很少使用但前景不错的一种外泌体分离方法。分离由横流力驱动，并基于颗粒的分子量或流体动力学直径。它包括高纯度、高效率和短时间处理，但迄今为止，FFF 在外泌体分离中的使用案例较少 ，还有待进一步开发 。
9.声学流体分离
   声学流体分离技术利用声场根据粒子的大小、密度和可压缩性来分离粒子。生物样品在此过程中不会受到损坏，并且分离的本身是非接触式、高效的和无标记的。
10.纳米粒径分析法
   确定性横向位移依赖于颗粒流动路径的变化，而颗粒流动路径取决于颗粒尺寸。这种方法虽然比较简单，但是需要使用扫描电镜技术、动态光散射技术、纳米粒子跟踪分析技术、单粒子干涉反射成像传感器（SP-IRIS）技术等。对于外泌体大小、形态、外泌体的 浓度、zeta电位等分析也可以使用Nanocoulter粒度分析仪。


11.介电泳分离法：
介电泳分离法主要利用不同大小的粒子在不均匀电场中的位置差异。外泌体被吸引到高电区域，而较大的颗粒将位于低电区域。该方法速度快，适合用于高通量筛选，但缺点是需要加热。
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